► 在线前处理GPC-GCMS联用技术测定奶粉及奶制品中的三聚氰胺
► 岛津GCMS-QP2010 Plus测定奶粉及奶制品中的三聚氰胺
► SCX-C18混合填料色谱柱分析奶粉中三聚氰胺
► 反相离子对色谱法分析奶粉中三聚氰胺
► 乳制品中三聚氰胺的LC- MS分析测定
► 反相离子对色谱法检测冰淇淋中三聚氰胺
► 奶粉中三聚氰胺新检测方案
摘要 GPC凝胶净化色谱和SPE固相萃取是目前在食品安全检测实验室常用的样品前处理方式。在线GPC可以实现GPC净化的在线完成，对乳制品中三聚氰胺的分析中能够进行较好的去除基质，使衍生化进行得更加彻底，检测限可以达到0.01mg/kg。
关键词 凝胶净化色谱；气质联用仪；三聚氰胺；前处理
1、实验部分
仪器条件和参数
岛津在线前处理联机系统GPC-GCMS
1.1 GPC条件：
流动相：丙酮+环己烷＝3+7，流量0.1mL/min。进样量20uL。
1.2 GCMS条件：
色谱柱：DB-5ms （30m×250um×0.25um）；
柱温：90℃，5min；15℃/min；190，0min；30℃/min；290，0min。
PTV进样口：120℃，5min；80℃/min；280，8min。5min后关闭分流阀。
质谱条件：scan模式，扫描范围m/z 86～400。SIM模式：m/z 342、327、328、171，定量离子m/z 342。
色质谱图见图2～6。
2、前处理方法
提取净化方法参照NY/T 1372-2007。
取样1～5g，按比例加入10倍量的二乙胺/水/乙腈=10/40/50(体积比)提取溶剂，混匀超声提取，取约1.5mL混合液，10000rmp离心5min，准确吸取1mL上清液过MCX（Waters，3cc，60mg）柱，依次用3mL水和3mL甲醇洗涤固相萃取柱，最后用3mL 5％氨化甲醇洗脱，洗脱液于70℃氮气吹干。按法衍生化，最后用氮气吹干衍生试剂，加入1mL流动相（GPC）后GPC-GCMS测定，进样20uL。
如图1，三聚氰胺TMS（3TMS）衍生物的GPC保留时间为3.29min（4min为溶剂峰），按仪器说明书编制GPC-GCMS的GPC部分和GCMS部分的条件。
3、结果与讨论
3.1 GPC在线前处理方法的优势
按NY/T 1372-2007（GC-MS法检出限0.05mg/kg），取5g样品，50mL提取液，最后取10mL（相当于1g样品）提取液过阳离子交换柱净化，很容易造成净化柱堵住，且取10mL过柱后由于杂质较多，衍生化的重现性很难做。本法只取1mL（相当于0.1g样品）提取液过阳离子交换柱，液体流过很通畅，最后净化效果与10mL样品过柱比要好得多。
本方法检出限为0.05mg/kg（相当于0.1g样品）。因为净化效果较好，衍生后的定容体积可以到0.2mL，检测限可以到0.01mg/kg（相当于0.1g样品）。
3.2 提取液的选择
同时测试了美国FDA用于测定宠物饲料的方法，用甲醇提取奶粉中的三聚氰胺，回收率很低（小于10％），且提取液中糖的含量较高，影响最后三聚氰胺的衍生化产率。用其它有机溶剂提取的方法都存在糖对衍生化的干扰，最后都要用阳离子交换的方法去除。
图1 标样和样品的GPC图
图2 40ng/mL三聚氰胺－3TMS（13.9min）标样SCAN模式下提取离子色谱图和质谱图
图3 100ng/mL三聚氰胺－3TMS标样（13.9min）SIM模式下提取离子色谱图和质谱图
图4 阴性样品提取离子色谱图（13.9min）
图5 上述样品加标2mg/kg的提取离子色谱图（回收率92％）
图6 某奶粉样品提取离子色谱图（20mg/kg）
4、小结
本文使用了在线前处理联机系统GPC-GCMS在奶制品中三聚氰胺的检测中，不但减少了样品分析的取样量，减少前处理时溶剂的使用量，使样品快速通过前处理柱，更好地去除干扰基质，使样品中目标化合物衍生化时更迅速、完全，检测的灵敏度更高，回收率结果满意，检测限可达到0.01mg/kg，满足各行业实验室对乳制品中三聚氰胺的分析检测要求。
参照NY/T 1372-2007，使用岛津的GCMS-QP2010 Plus测定了奶粉及液态奶制品中三聚氰胺的残留。
气相色谱质谱联用仪GCMS-QP2010 Plus
仪器设备
高速离心机（转速可达到10000r/min以上）
漩涡混合器
超声波清洗器
氮吹仪（控温60℃以上）
固相萃取装置及混合型阳离子交换固相萃取柱
高速匀质器
索氏提取器
震荡摇床
GCMS方法仪器主要配置
主机：GCMS-QP2010 Plus（EI源）
自动进样器：AOC-20i/s 或AOC-5000
色谱柱：Rtx-5ms 30m×0.25mm×0.25um（或同类型）
NIST谱库
GCMSsolution V2.5工作站（中文版或英文版）
（详细配置请见岛津公司专业配置报价清单）
分析方法
对样品进行前处理，三聚氰胺用三氯乙酸溶液提取，经混合型阳离子交换固相萃取柱净化后，用衍生化试剂（N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺BSTFA+1%三甲基氯硅烷TMCS）进行衍生，用GCMS进行定性分析和定量分析。检测方法完全满足目前三聚氰胺分析的要求。
载气：氦气
流速：1.3mL/min
进样量：1uL，不分流
进样口温度：250℃
升温程序：75℃（1min）-30℃/min-300℃（2min）
离子化方式：EI，70eV
离子源温度：230℃
接口温度：280℃
运行时间：10.5min
Scan：60-400m/z
SIM：99、171、327、342m/z
标准样品谱图
三聚氰胺（Melamine）含氮量为66.6％，折合成粗蛋白含量为416.27%，加入宠物饲料和牛奶中可以大幅提高蛋白质测定表观含量，但食用后可诱发肾衰竭并导致死亡，因此一直禁止在饲料和食品中使用。2007年，国内外发生多起宠物因食用添加了三聚氰胺的宠物食品而致死的例子，大量相关产品被召回。2008年9月，国内发生奶粉中三聚氰胺导致婴幼儿肾结石和肾功能衰竭甚至死亡的恶性事件。
目前对于三聚氰胺的检测，最常规的方法为LC方法。但由于该化合物含有三个有机氮基团，极性强，在普通C18反相柱上难以保留，无法达到分离效果。文献报导的HPLC方法基本都须加入离子对试剂以增加三聚氰胺的保留，但辛烷磺酸钠等离子对试剂恰恰限制了LC-MS的应用。本文采用新型的SCX-C18混合填料色谱柱测定三聚氰胺，该柱内填充的是均匀混合的SCX和普通C18填料颗粒，兼具离子交换和反相分离的特点，检测中不需加入离子对试剂，还可应用与LCsolution联机，操作简便，灵敏度高。
仪器概况
本实验使用岛津Prominence LC-20A高效液相色谱仪系统。LC-20A是岛津制作所投入整体力量开发的新一代高效液相色谱仪，具有以下特点：优越的基本性能，轻松满足客户对仪器严格的要求；全自动化操作，实现了分析的高效率；高度对应网络要求的综合管理系统，改善分析工作环境。
本次实验所用仪器的具体配置为LC-20AD输液泵，DGU-20A3在线脱气，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPD-20A紫外可见检测器，CBM-20A控制器和LCsolution色谱工作站。
分析方法
色谱柱：CAPcell Pak CR(1:4) 4.6×150mm 5μm
检测波长：243nm
流动相：15mM醋酸铵缓冲液(pH3.0):乙腈=7:3
流速：1.2mL/min
柱温：30℃
进样量：10μL
洗脱方式：等度洗脱。
样品前处理方法
取奶粉样品0.5g，准确加入5mL三氯乙酸溶液和0.2mL乙酸铅溶液，摇匀，超声提取20min。转入离心管，在10000r/min离心机上离心5min，取上清液, 0.45μm滤膜过滤，上机测定。
分析结果
1.保留时间与峰形
图1为本方法检测三聚氰胺标样的典型色谱图（样品浓度为5ug/mL）
图1 三聚氰胺标样图谱
由图1可见，本方法所测三聚氰胺保留时间为9.38min，峰形尖锐，对称性好。
2.精密度
取浓度为5μg/mL三聚氰胺标样，连续进样5次，结果如表1所示。
| 编号 | 保留时间(min) | 峰面积(μV.S) |
| 1 | 9.378 | 113178 |
| 2 | 9.388 | 112902 |
| 3 | 9.397 | 112677 |
| 4 | 9.397 | 112874 |
| 5 | 9.409 | 112909 |
| Average | 9.394 | 112908 |
| %RSD | 0.12 | 0.16 |
表1 保留时间与峰面积的重现性
由表1结果可见，本方法测定三聚氰胺具有良好的精密度和重现性。
3.标准曲线
取标准品，用缓冲液稀释成浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的标准工作液，分别进样，得到校准曲线(见图2)。
图2 校准曲线
结果表明，该方法线性良好，相关系数为0.9999。
4.加标回收率
取奶粉空白样品，加入不同浓度的三聚氰胺标准工作液，使奶粉中最终含量分别为0.5mg/kg、5mg/kg和50mg/kg，结果如下：
图3 空白奶粉
图4 空白奶粉添加0.5mg/kg三聚氰胺
图5 空白奶粉添加5mg/kg三聚氰胺
图6 空白奶粉添加50mg/kg三聚氰胺
加样回收率结果如表2所示。
| 加样量(mg/kg) | 计算结果(mg/kg) | 回收率 % |
平均回收率% |
| 0.5 | 0.55 | 109.3 | 115 |
| 0.60 | 120 | ||
| 5.0 | 4.56 | 91.2 | 92.9 |
| 4.72 | 94.5 | ||
| 50 | 48.6 | 97.2 | 97.8 |
| 49.2 | 98.4 |
表2 3个不同浓度样品回收率
5.检测限和定量限
用软件计算出奶粉中三聚氰胺含量检测限为0.43mg/kg ，定量限为1.31mg/kg。
6.实际样品分析结果
按本方法测定某品牌的奶粉，得到的图谱如图7所示。两份重复样品中测得三聚氰胺的浓度分别为19.7和19.8mg/kg，重现性良好。(用反相离子对色谱法测得的两次结果分别为19.1和19.2 mg/kg)
图7 某品牌阳性样品检测结果
结论
本方法定量限为1.31mg/kg，具有操作简单方便，灵敏度较高和重现性好等优点。流动相中不用加入离子对试剂，为LCMS的分析提供了可能。且样品经提取后可不用经过SPE步骤即可进样，大大简化了分析过程，节省了分析成本。本方法适合奶粉中三聚氰胺含量的测定，特别是大批量样品的低成本快速检测。
三聚氰胺（Melamine）简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。三聚氰胺含氮量为66.6％，折合成粗蛋白含量为416.27%，加入宠物饲料和牛奶中可以大幅提高蛋白质测定表观含量，但食用后可诱发肾衰竭并导致死亡，因此一直禁止在饲料和食品中使用。2007年，国内外发生多起宠物因食用添加了三聚氰胺的宠物食品而致死的例子，大量相关产品被召回。2008年9月，国内发生奶粉中三聚氰胺导致婴幼儿肾结石和肾功能衰竭甚至死亡的恶性事件。
本文参考农业部NY/T 1372-2007饲料中三聚氰胺测定方法中的样品提取纯化过程，采用反相离子对色谱法测定奶粉中三聚氰胺含量，重现性好，灵敏度高。
仪器概况
本实验使用岛津Prominence LC-20A高效液相色谱仪系统。LC-20A是岛津制作所投入整体力量开发的新一代高效液相色谱仪，具有以下特点：优越的基本性能，轻松满足客户对仪器严格的要求；全自动化操作，实现了分析的高效率；高度对应网络要求的综合管理系统，改善分析工作环境。
本次实验所用仪器的具体配置为LC-20AD输液泵，DGU-20A3在线脱气，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPD-20A紫外可见检测器，CBM-20A控制器和LCsolution色谱工作站。
分析方法
色谱柱：Inertsil C8 4.6×250mm 5μm
检测波长：235nm
流动相：含10mM柠檬酸和10mM辛烷磺酸钠的缓冲液(pH3.0):甲醇=7:3
流速：1mL/min
柱温：40℃
进样量：10μL
洗脱方式：等度洗脱。
样品前处理方法
参考农业部NY/T 1372-2007饲料中三聚氰胺测定方法中的样品提取纯化过程，并进行适当修改，具体步骤如图1所示。
图1 前处理步骤
分析结果
1.保留时间与峰形
图2为本方法检测三聚氰胺标样的典型色谱图（样品浓度为1μg/mL）
图2 三聚氰胺标样图谱
由图2可见，本方法所测三聚氰胺保留时间为11.02min，峰形尖锐，对称性好。
2.精密度
取浓度为5μg/mL三聚氰胺标样，连续进样5次，结果如表1所示。
|
编号 |
保留时间(min) |
峰面积(μV.S) |
|
1 |
11.016 |
214256 |
|
2 |
11.014 |
214205 |
|
3 |
11.014 |
214183 |
|
4 |
11.014 |
214292 |
|
5 |
11.013 |
214189 |
|
Average |
11.014 |
214225 |
|
%RSD |
0.01 |
0.022 |
表1 保留时间与峰面积的重现性
由表1结果可见，本方法测定三聚氰胺具有很好的精密度和重现性。
3.标准曲线
取标准品，用缓冲液稀释成浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的标准工作液，分别进样，得到校准曲线(见图3)。
图3 校准曲线
结果表明，该方法线性良好，相关系数为0.9999。
4.加标回收率
取奶粉空白样品，分别加入不同浓度的三聚氰胺标准工作液，使其三聚氰胺最终含量分别为0.5mg/kg，5mg/kg，结果如下：
图4 空白奶粉
图5 空白奶粉添加0.5mg/kg三聚氰胺
图6 空白奶粉添加5mg/kg三聚氰胺
扣除空白奶粉后的加样回收率结果如表2所示。
|
加样量(mg/kg) |
计算结果(mg/kg) |
回收率 |
平均回收率% |
|
0.5 |
0.55 |
96 |
110 |
|
0.64 |
114 |
||
|
0.67 |
120 |
||
|
5.0 |
4.68 |
95.8 |
96.0 |
|
4.80 |
94.6 |
||
|
4.95 |
97.6 |
表2 2个不同浓度样品回收率
5.检测限和定量限
用软件计算出奶粉中三聚氰胺含量检测限为0.026mg/kg，定量限为0.079mg/kg。
6.实际样品分析结果
按本方法测定某品牌的奶粉，得到的图谱如图7所示。两份重复样品中测得三聚氰胺的浓度分别为19.1和19.2mg/kg，重现性良好。
图7 某品牌阳性样品检测结果
结论
本方法定量限为0.079mg/kg，具有灵敏度高和重现性好等优点，适用于奶粉中三聚氰胺含量的准确测定，特别是低含量样品的检测。
三聚氰胺（Melamine）简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺。三聚氰胺含氮量为66.6％，折合成粗蛋白含量为416.27%，加入宠物饲料和牛奶中可以大幅提高蛋白质测定表观含量，但食用后可诱发肾衰竭并导致死亡，因此一直禁止在饲料和食品中使用。2007年，国内外发生多起宠物因食用添加了三聚氰胺的宠物食品而致死的例子，大量相关产品被召回。2008年9月，国内发生奶粉中三聚氰胺导致婴幼儿肾结石和肾功能衰竭甚至死亡的恶性事件。
本文建立对乳制品中三聚氰胺的单四级杆液质分析测定方法，以电喷雾离子化方式正离子模式监测，化合物的[M+H]+作为定量分析用的选择性检测离子,解决有时在液相分析时色谱分离不完全及定性信息不充分的问题, 从而避免液相色谱紫外测定时样品假阳性情况。
1. 实验及方法
1.1 装置概要
本实验使用Shimadzu LCMS-2010EV液相质谱仪，C-20AD输液泵，SIL-20AC自动进样器，CTO-20AC柱温箱,含LC-20AD输液泵，SIL-20AC自动进样器，CTO-20AC柱温箱，DGU-20A3在线脱气机, LCMSsolution 3.20工作站软件。
1.2 试剂
甲醇： 色谱纯
乙腈： 色谱纯
氨水： 浓度25%-28%
饱和乙酸铅溶液
缓冲液：配制含10mM柠檬酸和10mM辛烷磺酸钠的缓冲液，调节pH值到3.0
氨水甲醇溶液：量取5mL氨水，溶解于100mL甲醇中
1.3 样品前处理
固体样品取样2g，液体样品取样5g，准确加入9mL缓冲液溶液，加入1mL乙酸铅溶液。摇匀，剧烈震荡25min，10000r/min离心5min，取上清液。分别用3mL甲醇，3mL水活化混合型阳离子交换固相萃取柱，加入2mL（液体样品3mL）上清液上柱。依次用0.1mol/L盐酸水溶液3mL水和甲醇3mL洗柱，抽近干后用氨水甲醇溶液3mL洗脱。洗脱液50℃氮气吹干，残渣用70％乙腈溶解，0.45um滤膜过滤，上机测定。
1.4 分析条件
色谱柱：CAPCELL PAK CR（1:4） 4.6×150mm ,5μm；
流动相：乙睛/10mM NH4Ac (50:50)，
冰醋酸调节混合液至pH=3；
流速： 1.5mL/min (约0.3mL/min进质谱)；
柱温： 30℃；
进样量：10μL；
质谱参数：电喷雾离子化ESI(＋)，
雾化气: 1.5L/min，
干燥气: 0.1MPa，
CDL 温度：250℃，
加热块温度：200℃，
检测器电压: 1.6 kV
2. 实验结果
2.1 扫描方式结果见图1及图2
图1 TIC (+)
图2 SCAN (+) [M+H]+ m/z 127
2.2 标准曲线
三聚氰胺标准储备液：称取50mg（精确到0.1mg）的三聚氰胺标准品，用70%乙腈溶液溶解并定容于100mL容量瓶中，该溶液浓度为0.5mg/mL。
稀释标准储备溶液分别得到0.1μg/mL, 0.5μg/mL, 1μg/mL, 5μg/mL, 10μg/mL,50μg/mL分别进样，得到校准曲线如图3所示。质谱分析中选择性离子监测方式(SIM), m/z 127
图3 标准曲线
标准曲线方程Y = 410,165.3X + 261,083.0 (Y- 峰面积) 相关系数为0.9996，线性关系良好, 检出限为50ppb
2.3 标准品精密度数据
取浓度为1μg/mL三聚氰胺标样，连续进样5次，结果如表1所示。
表1 保留时间与峰面积的重现性
由表1结果可见，本方法测定三聚氰胺具有良好的精密度和重现性。
2.4 样品谱图结果
实际样品谱图结果见下图
图4 空白液态奶
图5 空白液态奶加标准品
3. 结论
单四级LCMS-2010EV分析乳制品三聚氰胺可以避免液相色谱紫外检测样品时假阳性结果, 并且其成本比使用串联质谱分析低, 可以很好的满足乳制品中三聚氰胺的分析测定要求。
摘要
对于许多食品，人们需要获悉其中蛋白质的含量，但是直接测定蛋白质的含量比较困难，通常通过测定氮原子的含量来间接推算其中蛋白质的含量。三聚氰胺（含氮量66%)与蛋白质（平均含氮量16%）相比含有更高比例的氮原子，因此被一些造假者利用，添加在食品中以造成食品蛋白质含量较高的假象。继2008年9月国内发生三鹿奶粉三聚氰胺事件后，伊利雪糕、大白兔奶糖、亨氏米粉、立顿奶茶等奶制品也相继被检测出含有三聚氰胺，严重损害了国内消费者的利益。
本文参考国标GB/T 22388—2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法中的样品提取纯化过程，采用反相离子对色谱法测定冰淇淋中三聚氰胺含量，重现性好，灵敏度高。
仪器装置
本实验使用岛津Prominence LC-20A高效液相色谱仪系统。具体配置为LC-20AD输液泵，DGU-20A3在线脱气机，SIL-20A自动进样器，CTO-20AC柱温箱，SPD-20A紫外可见检测器，CBM-20A控制器和LCsolution色谱工作站。
分析方法
色谱柱：Shimadzu VP-ODS 4.6×250 mm 5um
检测波长：240 nm
流动相：缓冲液：乙腈=90：10
（缓冲液配制方法：准确称取2.10 g 柠檬酸和2.16 g 辛烷磺酸钠，加入约980 mL 水溶解，调节pH 至3.0 后，定容至1L 备用）
流速：1 mL/min
柱温：40℃
进样量：20 μl
洗脱方式：等度洗脱。
样品前处理方法
参考国标GB/T 22388—2008原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法中的样品提取纯化过程，具体步骤如图1所示。
图1 前处理步骤
分析结果
1.保留时间与峰形
图2为本方法检测三聚氰胺标样的典型色谱图（样品浓度为0.8 ug/mL）
图2 三聚氰胺标样图谱
由图2可见，本方法所测三聚氰胺保留时间为24.40min，峰形尖锐，对称性好。
2.标准曲线
用流动相将三聚氰胺标准储备液逐级稀释得到的浓度为0.8、2、20、40、80 μg/mL 的标准工作液，浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程(见图3)。
图3 校准曲线
结果表明，该方法线性良好，相关系数为0.9999。
3.实际样品分析结果
按本方法测定两份冰淇淋样品(空白样品和阳性样品)，得到的图谱分别如图4和图5所示，空白样品在三聚氰胺出峰处无基质干扰。经计算，阳性样品中三聚氰胺的含量为1.40 mg/kg。
图5 阳性样品检测结果
结论
本方法具有仪器成本低，灵敏度高等优点，适用于冰淇淋中三聚氰胺含量的准确测定。
听到三聚氰胺，我们仍然心有余悸，不知什么时候它又会改头换面地卷土重来。我们需要有一双“火眼金睛”，不给它任何可乘之机。岛津公司的三重四级杆质谱仪LCMS-8030便是这样一双“火眼金睛”。
三聚氰胺(melamine )，简称三胺,学名三氨三嗪，是一种重要的氮杂环有机化工原料, 常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂。近来屡见新闻报道不法分子将含有三聚氰胺的原料用于乳制品生产。由于三重四级杆质谱仪具有多反应监测（MRM）的扫描模式，能够很好地去除基质干扰，因此能够对微量的三聚氰胺进行定量检测。国标《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388-2008）中规定了采用LC-MS/MS法测定乳及乳制品中的三聚氰胺，且该方法的定量限能到0.01 mg/kg。近期，岛津公司推出了基于三重四级杆质谱仪LCMS-8030的奶粉中三聚氰胺检测方案。
图1. 三聚氰胺的化学结构式
本检测方案建立了一种使用岛津三重四级杆质谱仪LCMS-8030测定奶粉中三聚氰胺的方法。样品经提取后，用超高效液相色谱LC-30A进行分离，三重四级杆质谱仪LCMS-8030进行定性和定量分析。该方法完全满足国标的要求，校准曲线的相关系数在0.999以上，3个不同浓度标准工作液的保留时间和峰面积相对标准偏差分别在0.64%和4.34%以下，方法定量限0.005 mg/kg，0.01 mg/kg样品的加标回收率为104.0%。
完全可以满足乳制品中三聚氰胺检测要求的岛津LCMS-8030三重四级杆质谱仪
详细内容，请咨询我司。
